Untuk mencari cinta sejati, Kanako Miyamae pindah ke sekolah Katolik Ame no Kisaki, terinspirasi oleh bagaimana orang tuanya saling jatuh cinta di sana. Hanya ada satu perbedaan: karena laki-laki membuat Kanako masuk angin, dia sebenarnya datang ke sekolah khusus perempuan untuk mencari pasangan dengan jenis kelamin yang sama.
Ketika dia bertemu dengan Mariya Shidou yang cantik, Kanako percaya dia telah menemukan seseorang yang spesial; Namun, ada lebih banyak hal dalam diri Mariya daripada yang terlihat—ternyata cinta pertama Kanako sebenarnya adalah anak laki-laki yang suka berdandan. Mariya mengancam untuk mengekspos niat tidak murni Kanako kecuali dia merahasiakan jenis kelaminnya yang sebenarnya, dan untuk memperburuk keadaan, dia juga menggantikan teman sekamar aslinya sehingga dia sekarang dapat terus mengawasinya.
Maria†Holic mengikuti Kanako saat dia mencari cinta di semua tempat yang salah dan mencari gadis impiannya—yaitu, jika dia bisa bertahan menjadi teman sekamar Mariya!
